NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NCR）試劑盒微量法說明書

微量法 100管/96樣 

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

產(chǎn)品名稱：NADPH細(xì)胞色素C還原酶（NCR）試劑盒微量法

貨號：LZ-S01262

規(guī)格 : 100管/96樣

測試方法:微量法

產(chǎn)品分類：P451系列

發(fā)貨地：上海

測定意義：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR作為P450酶系的重要一員，催化氧化型P450還原再生。

測定原理：

NCR催化NADPH還原氧化型細(xì)胞色素C，還原型細(xì)胞色素C在550nm處有特征吸收峰；通過測定550nm吸光度的增加速率，來計算NCR活性。
自備儀器和用品：
普通離心機，超速離心機、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一?粉劑×2 瓶，4℃保存?臨用前?據(jù)用??瓶加 100mL 蒸餾水充分溶解?

試劑??液體×1 瓶，4℃保存?

試劑й?粉劑×1 管，-20℃保存?臨用前配制，加 1.04 mL 蒸餾水充分溶解，4℃保存?

試劑四?粉劑×1 管，4℃保存?臨用前配制，加 1100 μL 蒸餾水充分溶解，4℃保存?

NAD+和 NADH 的提取：

1 血清（漿）中 NAD+和 NADH 的提取NAD+的提?。喊凑昭澹{）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 酸性提取液），60℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。NADH 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 堿性提取液），60℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2 組織中 NAD+和 NADH 的提取：NAD+的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g組織，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，60℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。NADH 的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g組織，加入 1mL 堿性提取液），冰浴研磨，60℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提?。篘AD+的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：酸性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL 酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），60℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。NADH 的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：堿性提取液體積（mL）500~1000：1的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），60℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

操作步驟:

1.加樣

1. 除包被外都需45度加樣

2.加樣體積要準(zhǔn)確

3.管底加樣,不能加在管壁上

4.加樣時不能產(chǎn)生氣泡

2.溫浴

1.加標(biāo)本后和加結(jié)合物后,應(yīng)立即放入按規(guī)定的反應(yīng)溫度的水浴箱。

2.各ELISA板不應(yīng)疊在一起。

3.為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋,或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的金屬濕盒中。

4.加入底物后,反應(yīng)的時間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。 如室溫20℃,ELISA板可避光放在實驗臺上,以便 不時觀察,待對照管顯色適當(dāng)時,即可終止酶反應(yīng)。

3.洗滌

1.洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)步驟,但卻是決定實驗成敗的關(guān)鍵。

2.目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或 抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特 異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。

4.讀板

1.陰性對照顏色極淺,在定性測定中一般可采用目視比色。

2.如用酶標(biāo)儀測定結(jié)果,準(zhǔn)確性決定于 ELISA板底的平整與透明度、酶標(biāo)儀的質(zhì) 量和軟件的算法。

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生化檢測試劑盒常見問題：

在使用生化檢測試劑盒時，可能會遇到一系列常見問題，這些問題主要涉及到試劑盒的使用、保存、有效期、樣本處理以及實驗操作等方面。以下是一些常見的問題及其解決方法：

一、?測定原理?：生化試劑盒通過化學(xué)反應(yīng)或酶促反應(yīng)測定樣本中物質(zhì)的含量或酶活性。常用的儀器包括分光光度計和酶標(biāo)儀，它們的測定原理基于朗伯-比耳定律。土壤、水質(zhì)、動植物組織、血清、細(xì)胞細(xì)菌、食品等樣本均可進行測定?。

?二、選擇不同規(guī)格的試劑盒?：根據(jù)實驗的實際情況選擇合適的試劑盒。如果實驗室有酶標(biāo)儀且具備檢測波長，可以選擇微量法試劑盒；如果有分光光度計及相應(yīng)規(guī)格的比色皿，則可以選擇常量法或微量法試劑盒。建議購買前仔細(xì)閱讀說明書，確認(rèn)自備的儀器和試劑是否符合要求?。

?三、保存方法?：收到試劑盒后，如果暫時不用，應(yīng)按照外包裝上指示的溫度保存。拆開包裝后，應(yīng)按照每個試劑的保存溫度進行保存，注意有些試劑忌反復(fù)凍融，有些粉劑溶解后性質(zhì)不穩(wěn)定?。

四、?有效期?：一般生化試劑盒的有效期為6個月，也有特殊貨號的有效期為1年。具體以實際收到貨物的標(biāo)簽信息為準(zhǔn)?1。

?五、樣本處理?：新鮮樣本和冷凍樣本都可用于大多數(shù)指標(biāo)的測定，但有些生理活性物質(zhì)容易降解，建議使用新鮮樣本測定。對于冷凍樣本，建議在-70℃或液氮中保存。樣本在不同溫度下的保存時間有所不同，例如4℃可保存一周，-20℃保存一個月，-80℃保存3個月?。

?六、土壤酶活性測定?：對于土壤酶活性的測定，建議將鮮土風(fēng)干并過篩后取樣，以測定的重復(fù)性。若使用鮮土測定，需樣本的顆粒大小一致且水分含量相似?。

七、?預(yù)測定?：在進行正式測定前，建議選擇2-3個預(yù)期結(jié)果差別較大的樣本做預(yù)實驗。通過預(yù)測定可以全面反映樣品特點、試劑質(zhì)量、儀器設(shè)備穩(wěn)定性和操作規(guī)范性，確保正式測定結(jié)果真實可靠?。